Estensione e potenziamento del microscopio ottico per l’incremento qualitativo e produttivo della ricerca in campo biologico e medico

sarlifigura3Autore/i del lavoro candidato: Filippo Piccinini

SINTESI CONTENENTE UNA BREVE DESCRIZIONE DEL LAVORO SVOLTO E DEI RISULTATI OTTENUTI: Lo sviluppo tecnologico è alla base del progresso scientifico. L’innovazione degli strumenti di analisi fornisce ai ricercatori nuove opportunità per esplorare campi fino a quel momento irraggiungibili. Tra tutti i dispositivi oggi presenti in un laboratorio biologico, il microscopio ottico è quello più diffuso e rappresentativo. Esso è considerato lo strumento di base per centinaia di migliaia di ricercatori nel mondo, e la maggior parte delle scoperte nel campo delle scienze della vita è legata all’uso di questo strumento. Un miglioramento significativo delle prestazioni di questo strumento (ad esempio, maggior ingrandimento, miglior risoluzione) o l’estensione delle sue attuali capacità (quali, ad esempio, campo di vista, piani focali) può risultare determinante, ed indurre un incremento produttivo in una miriade di siti e di applica zioni. Nonostante la progressiva evoluzione nei secoli del microscopio ottico, alcune problematiche ancora presenti ne limitano l’utilizzo come uno strumento realmente affidabile per l’analisi quantitativa di un campione istologico o cellulare. Per prima cosa, la dimensione dell’area osservabile è inversamente proporzionale all’ingrandimento ed estremamente limitata, tipicamente qualche decina di mm2 ad ingrandimento 4x, fino a centesimi di mm2 con obiettivi 40x e superiori. Questo rende impossibile osservare i dettagli di un intero campione, e difficile ottenere misure statisticamente significative di un tessuto o una popolazione cellulare. Inoltre, non è possibile visualizzare completamente a fuoco oggetti di “grandi” dimensioni, e quindi tipicamente ci si limita a osservare istologie di tessuti o cellule che crescono su una superficie piatta. Infine, la non omogeneità della distribuzione di luce sul campione rende non confrontabili cellule e parti di tessuto presenti in diff erenti posizioni dell’immagine. Tuttavia, soluzioni software basate sul post processing delle immagini acquisite possono portare a estendere le capacità del microscopio, alleggerendo questi limiti tecnologici che impediscono di eseguire analisi quantitative del campione. In questo lavoro abbiamo realizzato un insieme di algoritmi open source volti a estendere il campo di vista, amplificare la profondità di campo e rendere la distribuzione di luce delle immagini acquisite con un microscopio ottico uniforme. Questo ha permesso di fornire ai ricercatori una soluzione a “costo zero” che consente loro di utilizzare il microscopio come un vero strumento per analisi quantitative. In particolare abbiamo sviluppato, e gratuitamente distribuito, i seguenti software: 1) MicroMos (MICROscopy image MOSaicing), per “incollare” in maniera automatica una sequenza di immagini parzialmente sovrapposte, al fine di ottenere una unica immagine (denominata mosaico, o “panoramica”) dell’intera coltura cellulare o provino istologico ([04], [06]). 2) GridMos (counting GRID MOSaicing), per ottenere un mosaico relativo ad una intera camera di conta cellulare (ad esempio KOVA slide, camera di Burker), al fine di automatizzare la conta riducendo l’errore assoluto, e la stima della percentuale di cellule vive e morte ([07]). 3) DOFE (Depth Of Focus Extender), per fondere una serie di immagini acquisite a diverse profondità, al fine di ottenere un’immagine completamente a fuoco di oggetti caratterizzati da spessore non trascurabile, quali ad esempio gli sferoidi multicellulari tipicamente utilizzati per testare farmaci e trattamenti radioterapici ([02], [08], [09]). 4) CIDRE (Corrected Intensity Distributions using Regularized Energy minimization), per correggere la distribuzione di luce non uniforme delle immagini, utilizzando informazioni provenienti solo dalle immagine stesse. In pratica, senza richiedere nessuna informazione a priori, CIDRE consente di correggere la deformità del campo di luce di tutte le immagini acquisite per mezzo di un qualsiasi microscopio ([01], [05], [10]). 5) CellTracker (in vitro Cell Tracker), consente di tracciare in maniera automatica cellule seminate su superfici monodimensionali, al fine di stimare in maniera automatica diversi parametri (ad esempio direzione di migrazione, velocità di spostamento) caratteristici della popolazione cellulare in esame ([03]). Per validare i metodi proposti e provare i miglioramenti ottenuti grazie alle nuove soluzioni presentate, tutti gli algoritmi sviluppati sono stati confrontati con i riferimenti allo stato dell’arte del settore. In particolare: 1) MicroMos: la nuova modalità di registrazione proposta è stata confrontata con quelle attualmente utilizzate. L’errore quadratico medio, il rapporto segnale rumore e l’indice di qualità visiva dei mosaici ottenuti registrando nella nuova modalità varie sequenze di immagini campione, sono risultati significativamente migliori. 2) GridMos: abbiamo dimostrato che entrambi gli errori intra- and inter-operatore diminuiscono se le cellule vive e morte, e il numero totale di cellule di una coltura vengono stimati partendo da un mosaico della camera di conta e marcando off-line le cellule con indicatori di colori differenti. 3) DOFE: il nuovo metodo proposto per la fusione di z-stack di immagini confrontato con cinque software ampiamente utilizzati in letteratura. Differenti metriche sono state impiegate per valutare la qualità delle immagini finali ottenute. I risultati raggiunti con DOFE sono stati sempre i migliori, o comparabili con i migliori ottenuti, sia nei test eseguiti utilizzando immagini sintetiche, sia negli esperimenti con immagini reali. 4) CIDRE: utilizzando dodici datasets con caratteristiche differenti, ed acquisiti con varie tecnologie, abbiamo confrontato tra loro i tredici approcci di normalizzazione di immagini attualmente proposti in letteratura. CIDRE ha fornito in generale i risultati mediamente migliori, superando ampiamente tutti gli altri metodi nel caso di dataset composti da un numero considerevole di immagini (cioè, alcune centinaia) come quelli tipicamente acquisiti in high content screening. 5) CellTracker: abbiamo confrontato le varie tipologie di algoritmi di tracciamento , dal tracciamento completamente manuale al completamente automatizzato. I risultati ottenuti dimostrano che i metodi automatici o semi-automatici implementati in CellTracker, basati sul approcci di template matching, possono essere efficientemente utilizzati per tracciare cellule in diversi contesti applicativi, anche in sequenze di immagini a basso contrasto come quelle tipicamente acquisite in phase-contrast e differential interference contrast (DIC). Concludendo, grazie ai software realizzati e gratuitamente distribuiti è ora possibile estendere a “costo zero” qualsiasi comune microscopio ottico per: a) ottenere una singola immagine rappresentativa di un intero tessuto istologico o coltura cellulare; b) acquisire immagini di colture cellulari tridimensionali; c) ottenere immagini con campo di intensità artificialmente rettificato. In questo modo abbiamo fornito ai biologi ed ai ricercatori un nuovo strumento, automatizzato in modo virtuale, che consente di ottenere misure quantitative dei campioni, ed aprire quindi le porte a nuovi orizzonti nella ricerca.

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