Indagini sul ruolo dei fenoli dell’olivo nello sviluppo della rogna per individuare nuove strategie di lotta alla malattia

rogna olivoAutore/i del lavoro candidato: Chiara Cortese

SINTESI CONTENENTE UNA BREVE DESCRIZIONE DEL LAVORO SVOLTO E DEI RISULTATI OTTENUTI: La rogna dell’olivo, causata da Pseudomonas savastanoi pv. savastanoi (Psv), è una malattia diffusa in molti Paesi olivicoli del bacino del Mediterraneo, che si manifesta con la formazione di tubercoli su branche, rami e foglie. Negli ultimi anni, un’elevata incidenza di questa malattia è stata rilevata nella provincia di Perugia, provocando consistenti perdite produttive per la diffusa coltivazione di varietà pregiate, come Fratoio e Moraiolo, suscettibili alla malattia. All’interno dei tubercoli generati dal batterio vivono alcuni endofiti: Pantoea agglomerans, Erwinia toletana e Erwinia oleae, che formano con il patogeno un consorzio stabile in grado di aggravare la mala ttia. I composti fenolici dell’olivo, che forniscono una difesa naturale contro i fitopatogeni, aumentano nei tubercoli, suggerendo che l’aggressività del batterio sia in parte dovuta alla loro capacità di degradare i fenoli. Essendo questa, una malattia molto difficile da controllare e i pochi mezzi di lotta a disposizione mostrano un’efficacia spesso non soddisfacente, lo studio dei meccanismi di aggressione del patogeno, del ruolo degli endofiti e dei meccanismi naturali di difesa della pianta potrebbero fornire utili informazioni per sviluppare strategie di difesa mirate, efficaci e ecocompatibili. Il progetto di ricerca ha riguardato sui seguenti obiettivi: • Sequenziamento, annotazione e analisi comparative dei genomi di un ceppo di P. savastanoi pv. savastanoi (Psv), un ceppo di P. agglomerans (Pa) e E. oleae (Eo) isolati in Umbria; • Studio, nel tubercolo d’olivo, dell’interazione/co-localizzazione del patogeno Psv con i batteri endofiti Eo e Pa, in collaborazione con l’Università degli Studi di Malaga (Departmento De Biologia Celular, Genetica y Fisiologia); • Verifica in vitro se i fenoli dell’olivo (principalmente oleuropeina, altri secoricoidi e derivati): sono tossici nei confronti di Psv e/o degli endofiti; sono degradati od utilizzati da Psv e/o dai batteri endofiti da soli o in combinazione; • Stabilire in planta se Psv e gli endofiti da soli o in combinazione provocano variazioni nel profilo dei composti fenolici nel tubercolo generato da Psv o dalla combinazione di Psv con ciascun endofita. L’analisi del genoma del ceppo DAPP-PG 722 di Psv ha evidenziato la presenza di diversi fattori di patogenicità e di virulenza, quali il cluster genico hrp/hrc; cinque sistemi di secrezione (sistema di secrezione di tipo I, II, III, IV e VI); i geni codificanti per gli effettori proteici di tipo III; geni coinvolti nella biosintesi di fitormoni quali acido-3-indolacetico e citochinine coinvolti nella formazione del tubercolo; e regioni variabili codificanti per i pathway di degradazione di composti fenolici prodotti dalla pianta. Il ceppo di Pa DAPP-PG 734, in grado di indurre reazione di ipersensibilità in piante non ospite di tabacco, produce acido indolacetico e quando inoculato in associazione al patogeno è in grado di modulare la virulenza causando un aumento del volume del tubercolo. L’analisi del genoma di Pa DAPP-PG 734 ha evidenziato la presenza di un completo cluster genico hrp/hrc e i sistemi di secrezione di tipo I, II, III, IV e VI. Sono stati individuati altri fattori di virulenza, quali geni codificanti per la produzione di polisaccaridi extracellulari; geni coinvolti nella biosintesi di siderofori e nella produzione di IAA. E’ stata rilevata la presenza del sistema di comunicazione Quorum sensing mediato da acil-omoserina lattoni. L’analisi genomica del ceppo di Eo DAPP-PG 531 ha dimostrato che si tratta di un organismo totalmente nuovo dato che presenta una bassa similarità con i genomi di specie filogeneticamente vicine appartenenti al genere Erwinia. Da notare la presenza d el sistema di comunicazione Quorum sensing mediato da acil-omoserina lattoni. Con il presente lavoro è stato ottenuto e caratterizzato fenotipicamente il mutante del gene omologo di luxR in Eo DAPP-PG 531. Lo studio dell’interazione tra Psv e i batteri endofiti Eo e Pa è stato svolto in collaborazione con l’Università degli Studi di Malaga (Departmento De Biologia Celular, Genetica y Fisiologia). I ceppi Psv, Pa e Eo sono stati trasformati con proteine fluorescenti, inoculati in piante di olivo micro propagate in vitro e i tubercoli analizzati mediante tecniche di microscopia epifluorescente. In particolare i ceppi sono stati trasformati con plasmidi codificanti per proteine fluorescenti quali Red fluorescent protein (RFP) per Pa e Eo e Green fluorescent protein (GFP2) per Psv. Le inoculazioni sono state svolte in piante di olivo (Oleae europea L.) derivanti da semi germinati in vitro (cv Arbequina). Pa e Eo sono stati inoculati singolarmente o co-inoculati con il pat ogeno Psv. L’infezione batterica è stata monitorata in tempi reali combinando l’epifluorescenza e la microscopia confocale. Le immagini acquisite e analizzate mediante Leica LAS AF software hanno rilevato che i batteri endofiti localizzano nelle vicinanze del patogeno e risultano molto più abbondanti e visibili quando co-inoculati con il patogeno, confermando la necessità di crescere e moltiplicarsi nel tubercolo nelle vicinanze del patogeno. La recente analisi dei genomi del ceppo perugino di Psv assieme ai genomi dei due endofiti, ha permesso di rilevare in tutte e tre le specie la presenza di enzimi coinvolti nelle vie di degradazione dei fenoli, facendo ipotizzare un adattamento di Psv e degli endofiti alla detossificazione e/o utilizzo di tali composti. L’azione antimicrobica dell’oleuropeina è stata testata sia nei confronti del patogeno Psv, che dei due endofiti. Le sospensioni batteriche alla concentrazione di 108 cfu ml-1 sono state incubate singolarmente in terreno LB liquido con l’aggiunta del composto fenolico a diverse concentrazioni, per 24h a 27°C in agitazione monitorando la crescita batterica ogni ora. L’oleuropeina alla concentrazione di 3000 µM ha manifestato un’azione antimicrobica nei confronti di Psv e Eo; mentre non ha alterato la crescita di Pa. Per stabilire se Psv e gli endofiti da soli o in combinazione provocano in planta variazioni nel profilo dei composti fenolici nel tubercolo Psv e i batteri endofiti Pa e Eo sono stati co-inoculati (ratio 1:1) in piante di olivo lignificate (cv. Frantoio), e il profilo fenolico dei tubercoli è stato analizzati dopo 60 giorni dall’inoculazione mediante, analisi HPLC e tecniche di spettrometria di massa.