MATRICI DI NICCHIOIDI SINTETICHE PER LA COLTIVAZIONE DI CELLULE STAMINALI

Autori del lavoro candidato: Manuela Teresa Raimondi
SINTESI CONTENENTE UNA BREVE DESCRIZIONE DEL LAVORO SVOLTO E DEI RISULTATI OTTENUTI: L’impossibilità dello stato dell’arte di mantenere indifferenziate le cellule staminali adulte (ASc) in coltura prolungata limita notevolmente le loro potenzialità applicative nel campo della medicina rigenerativa e dell’ingegneria dei tessuti. Recentemente si è dimostrato come substrati con struttura definita e tridimensionale, che mimano l’ambiente fisiologico della nicchia staminale naturale, favoriscano il mantenimento della multipotenza delle ASc in colture prolungate, promuovendo uno stato di sforzo isotropico. Uno dei risultati più rilevanti è stato ottenuto dalla prof. Raimondi seminando cellule staminali mesenchimali (MSc) su un “nicchioide”, a geometr ia controllata, ottenuto tramite tecnica di polimerizzazione laser a due fotoni (2PP): si è visto infatti che la densità cellulare interna alla nicchia sintetica è del 70% più elevata rispetto alla regione esterna. Inoltre le cellule in essa contenute non esprimono marker di differenziazione, suggerendo come il nicchioide promuova un significativo effetto di mantenimento della staminalità. In un altro esperimento è stato valutato l’effetto del nicchioide su una popolazione cellulare decisamente più reattiva e con un potere differenziativo superiore alle MSc: le cellule embrionali staminali murine (mESc). Per valutare l’influenza della nicchia sintetica relativamente a pluripotenza e differenziamento, sono stati coltivati due substrati distinti: il nicchioide e un controllo 2D (vetro). Le colture sono state portate avanti per 14 giorni in assenza di condizionamento chimico. I risultati mostrano che la nicchia promuove il mantenimento della pluripotenza, tramite l’espressione del marker OCT4, in modo significativamente superiore ai due controlli presenti e che inibisce nel contempo il differenziamento, caratterizzato da marker quali GATA4, αSMA e NKX2-5, che invece risultano espressi sul controllo in vetro. Ciò dimostra che la nicchia è in grado di esercitare uno stato di sforzo favorevole al mantenimento della pluripotenza anche nei confronti delle mE Sc. Il nicchioide permette di ridurre l’effetto di una superficie 2D che causa la perdita di staminalità delle cellule in coltura. Questo permette quindi di dimostrare che la geometria 3D e la conseguente modalità di adesione cellulare è uno stimolo importante, forse il principale, che determina il mantenimento della multipotenza delle MSc. In maniera ancora più significativa, la versione del nicchiode a blocchi di 5×5 nicchie, consente di estendere la superficie per la coltura ricoperta dalle nicchie fino ad un’area di 1 cm2, compatibile con il suo utilizzo per l’applicazione clinica delle cellule ivi coltivate come prodotto terapeutico. Dunque i nicchioidi, e in modo particolarmente vantaggioso il substrato ricoperto dai nicchioidi, possono essere utilizzati per la coltura e riproduzione di cellule staminali indifferenziate. Ottenendo un numero elevato di cellule, esse possono essere iniettate in un paziente per curare patologie attualmente incurabili come, per esempio, l’artrosi, la neurodegenerazione (come Parkinson e Alzheimer), il morbo di Crohn, le lesioni del midollo spinale, i traumi dei tessuti cartilagineo ed osseo, l’infarto del muscolo cardiaco. I vantaggi del nicchioide rispetto ai sistemi tradizionali di cultura cellulare, quali piatti di coltura e fiasche, a lunghi tempi di coltura fino a tre settimane, sono: 1) la densità cellulare aumenta di 4 volte senza aggiunta di fattori proliferativi solubili; 2) l’espressione di markers di staminalità viene mantenuta confrontabile con quella di cellule non espanse, senza aggiunta di fattori solubili che mantengono la pluripotenza (compreso il “leukemia inhibitory factor” o LIF); poiché l’amministrazione al paziente di fattori solubili crea dei rischi, le cellule coltivate nel nicchioide sono più adatte all’applicazione clinica nel contesto di una terapia cellulare. I vantaggi del nicchiode rispetto ad altri sistemi di coltura tridimensionali quali scaffold porosi o matrici tridimensionali in idrogelo sono: 1) tutte le esistenti tecniche analitiche possono essere utilizzate sulle cellule (comprese la tripsinizzazione, le colorazioni, l’immunofluorescenza, la microscopia ottica, l’istologia, l’istochimica, ecc), perché il nicchioide, pur essendo un substrato totalmente tridimensionale per le cellule, è spesso solo 30 micron quindi è accessibile in microscopia ottica standard. Il nicchioide, oggetto dell’innovazione che vogliamo candidare al premio, è un substrato avanzato per la coltura in vitro di cellule staminali dette “mesenchimali”. Queste cellule si possono isolare dal midollo osseo di pazienti adulti, far proliferare, e re-iniettare nei pazienti stessi per la cura di patologie infiammatorie. Ad oggi, la scienza ha già dimostrato che il loro utilizzo ha un effetto terapeutico in molte gravissime patologie, quali l’artrosi, la neurodegenerazione (come Parkinson e Alzheimer), il morbo di Crohn, le lesioni del midollo spinale, i traumi dei tessuti cartilagineo ed osseo, l’infarto del muscolo cardiaco. Ciononostante, l’applicazione clinica delle cellule staminali mesenchimali sull’uomo è ancora impedita dai rischi connessi alle sostanze chimiche usate per mantenere la staminalità delle cellule quando vengono stimolate a proliferare in coltura. L’innovazione del nicchioide consiste nello stimolare la proliferazione, anziché con farmaci, facendo aderire le cellule in modo tridimensionale a micro-gabbiette o “nicchioidi”, che imitano l’architettura della “nicchia” staminale, che è la sede naturale dove vivono queste cellule nel nostro organismo. Lo sforzo tecnologico che ha portato alla realizzazione dei nicchioidi è stato enorme, poiché si è reso necessario controllare la geometria del substrato alla scala della dimensione di ogni singola cellula, cioè il milionesimo di metro (detto “micron”). L’alleanza di ricerca tra la Prof. Raimondi, bioingegnere, il collega fisico Prof. Cerullo e il micro-tecnologo Dr. Osellame, ha consentito di adattare una tecnica di micro-fabbricazione di frontiera detta “polimerizzazione laser a due fotoni” all’applicazione biomedica. Questo adattamento ha richiesto tre anni di lavoro di ottimizzazione sia dei materiali utilizzati per la fabbricazione del substrato, consistenti in fotopolimeri ibridi organici-inorganici, sia della procedura di polimerizzazione laser, che è stata scalata dal volume microscopico del singolo nicchioide, fino alla copertura di superfici di decine di centimetri quadri necessarie per la coltura cellulare. Il gruppo di ricerca ha depositato un brevetto specificamente sugli aspetti tecnologici legati alla micro-fabbricazione del nicchioide. Le prospettive di industrializzazione e commercializzazione di questo substrato innovativo sono enormi. Il nicchioide ha il potenziale di dominare il mercato dei prodotti per coltura cellulare, destinati sia alla ricerca, che alla diagnostica, che alla terapia cellulare. Da sola, la terapia cellulare è attualmente un mercato da 10 miliardi di dollari/anno, in aumento esponenziale, di cui il 25% è focalizzato sulla terapia cellulare con cellule staminali mesenchimali, coltivabili nel nicchioide.